多拉菌素為20世紀90年代研制開發的新一代大環內酯類抗寄生蟲藥，其生物合成途徑是以環己烷羧酸為前體，經多步生物合成，形成多拉菌素。其產生菌為基因工程菌，是產阿維菌素的阿維鏈霉菌經基因重組后，而得到主產多拉菌素的基因工程菌。多拉菌素是一種阿維菌素類抗生素，是阿維菌素的第三代衍生物。與其他大環內酯類抗生素不同，其生物學活性主要表現為高效驅殺動物體內外寄生蟲。經過近20年的研究，它被認為是目前阿維菌素族中優秀的抗寄生蟲藥物之一，因其具有驅蟲范圍廣、半衰期長、作用效果好、體內殘留低和無不良反應等優點，是目前具有開發潛力的獸用抗寄生蟲藥物之一。

多拉菌素屬脂溶性藥物，可溶于許多有機溶劑如二甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙二醇和二甲基亞砜等，但在水中的溶解度極低，僅為0.0006～0.0009mg/L，相對分子質量為899.11。由于多拉菌素屬于胞內產物，存在于菌體內，且發酵液中組分十分復雜，多拉菌素的濃度很低，需通過各種分離提取技術來實現目標產物的富集。目前，國內一方面由于有專利的限制，生產多拉菌素的廠家較少，對于多拉菌素的需求主要依賴于進口；另一方面，對多拉菌素的工業化生產起步較晚，分離純化工藝等還缺乏系統性的研究。本文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素工藝，優化了工藝過程中的操作參數，旨在闡述陶瓷膜提取技術比傳統提取技術的優勢，從而實現陶瓷膜技術在多拉菌素提取中的工業化應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料性質和前處理

多拉菌素發酵液由浙江海正藥業股份有限公司提供，呈灰色的渾濁狀，濕固含量40%～42%，黏度700mPa·s，pH7～8，發酵液溫度37℃。

1.1.2 化學試劑

HPLC用的甲醇和乙腈均為色譜純，購自Fisher公司；提取用的甲醇為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；多拉菌素標準品購自Sigma公司。

1.2 陶瓷膜設備

陶瓷膜元件：陶瓷膜材質為氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦，通道數為19，長度1200mm，平均孔徑為50nm。膜組件：單支膜組件，面積0.42㎡。陶瓷膜設備為防爆型。其中泵參數：流量Q=5.8m3/h，揚程H=56.5m，功率P=1.1kW。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

（1）傳統提取法：將50mL多拉菌素發酵液先經3500r/min離心10min，棄濾液，收集固體物（菌體）。菌體用甲醇浸泡，于室溫下，震蕩提取12h，再經離心，去除大分子等沉淀物，收集離心液，即得到多拉菌素甲醇提取液。并應用高效液相色譜分別檢測發酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。

往菌體中分別添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV（BV表示倍數，質量比，相對于發酵液，以下皆同）甲醇溶液提取1次，考察不同甲醇添加倍數對多拉菌素收率的影響；在較優甲醇添加倍數的前提下，對收集的菌體分別提取1次、2次和3次，考察不同甲醇提取次數對多拉菌素收率的影響。

（2）陶瓷膜提取法：將40kg多拉菌素發酵液置于陶瓷膜設備中，采用錯流過濾方式，設定操作壓力2.3bar，膜面流速4m/s，溫度30～45℃，將發酵液濃縮至2.67倍，棄去陶瓷膜滲透液，獲得循環罐中的菌體；然后開始加1.5BV純水連續洗濾菌體；待結束后再用3BV甲醇溶液連續提取菌體中的多拉菌素，收集陶瓷膜滲透液，即為多拉菌素甲醇提取液。并應用高效液和色譜分別檢測發酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。

（3）陶瓷膜操作參數的優化：

①膜面流速的優化：取40kg多拉菌素發酵液置于陶瓷膜設備中，提高膜面流速至5m/s，控制操作壓力2.3bar，溫度23～44℃，陶瓷膜濃縮2.67倍，加1.5BV純水連續洗濾菌體，加3BV甲醇連續提取多拉菌素，考察膜面流速對陶瓷膜過濾通量的影響。

②操作壓力的優化：取40kg多拉菌素發酵液置于陶瓷膜設備中，設定濃縮階段操作壓力1.3bar，加1.5BV純水連續洗濾階段操作壓力1.8bar，加3BV甲醇連續提取階段操作壓力2.4bar，膜面流速5m/s，溫度27～45℃，陶瓷膜濃縮2.67倍，按照以上方法提取多拉菌素，考察階段性提高操作壓力對陶瓷膜過濾通量的影響。

1.3.2 分析方法

（1）有效成分的測定：采用高效液相色譜法。

（2）膜表征方法：陶瓷膜水通量測定：設備穩定運行10min后，直至水通量基本穩定，測定條件為1bar、常溫下測量水通量。可直接讀取浮子流量計刻度或通過以下公式計算：

J=Z/(S×t)

式中：J為水通量，單位L/(h·㎡)；Z為t時間內滲透水的體積，單位L；S為膜面積，單位㎡；t為測量的時間，單位h。

料液通量測定：測定膜過濾過程中某一時間段的通量情況，即計算出單位時間、單位膜面積滲透液的通量值。

膜過濾通量測定：記錄膜過濾的耗時（即從進料開始至停止出料所用時間），測定系統滲透液的總質量，并計算出單位時間、單位膜面積濾液的通量值。

多拉菌素的收率：物料提取后多拉菌素質量與發酵液中多拉菌素質量的百分比。

2 結果與討論

2.1 傳統工藝提取多拉菌素

鄒澤先等考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及異丙醇等提取試劑對多拉菌素提取的效果差異，結果表明以乙腈及甲醇的提取效果較好，且兩者差異不顯著，但甲醇的成本及毒性均較乙腈低，故提取試劑選擇甲醇。往菌體中分別添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV甲醇溶液提取1次，隨著甲醇添加倍數的提高，多拉菌素的提取收率越高。當添加倍數為3BV時，收率提高幅度有所下降，且溶劑添加的越多，也增加了甲醇購買和后續回收的成本，因此選擇甲醇添加倍數為3BV，其收率可達92.1%。

按照甲醇添加倍數為3BV，提取1次、2次和3次多拉菌素收率分別為92.3%、96.3%和97.3%。結果表明，隨著提取次數的增加，收率呈現逐漸提高的趨勢，提取3次時收率僅提高了0.8%，故選擇對發酵液進行甲醇提取2次。

2.2 陶瓷膜法提取多拉菌素

多拉菌素為胞內代謝產物，不溶于水，可溶于大部分有機溶劑。傳統工藝一般通過離心收集和洗滌菌體，再將菌體通過有機溶劑溶出或機械破碎的方式提取其中有效成分，目前普遍采用較為安全有機溶劑甲醇來提取。此法主要存在人工操作復雜、處理時間長、收率低等缺點，因此，下文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素發酵液，考察陶瓷膜技術對多拉菌素提取的影響，并優化操作參數，如操作壓力和膜面流速等。

2.2.1 陶瓷膜提取技術的實驗結果

由于物料固含量較高，隨著濃縮倍數的提高，通量急劇下降，陶瓷膜濃縮2.67倍，瞬時通量僅為25L/(㎡·h)。起始加甲醇使得整體濃度下降，通量明顯升高，但隨著提取時間的延長，胞內的部分大分子物質也被溶出，且逐漸污染陶瓷膜，使得膜通量也呈現緩慢下降的趨勢。設備運行130和270min時的通量存在振蕩，主要是由于加水洗濾和加甲醇提取每次1L，視為連續，在這期間通量也存在起始較高，然后隨著濃度升高，通量逐漸下降的趨勢，主要是存在檢測時間偏差的問題。本次試驗共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時360min，膜過濾通量可達81.3kg/(㎡·h)。陶瓷膜滲透液澄清透明，無菌體或細胞碎片透出，收率可達97.6%，其結果均優于傳統除雜提取工藝。因此，陶瓷膜技術可實現多拉菌素的連續提取。

2.2.2 陶瓷膜膜面流速的優化

膜面流速的提高有利于增大料液與膜之間的剪切力，從而減緩膜污染的速度。本次試驗提高膜面流速至5m/s。提高膜面錯流流速可提高料液通量，主要表現在整體瞬時通量提高，且通量下降幅度減小。共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時290min，膜過濾通量可達100.9kg/(㎡·h)，比膜面流速4m/s提高了24.1%，收率可達97.2%。因此，可將膜面流速提至5m/s。

2.2.3 陶瓷膜操作壓力的優化

由于多拉菌素發酵液固含量較高，對膜的污染較為嚴重，通量也隨之大幅度下降，且操作壓力與膜污染的程度呈正相關，故本次實驗采用階段性提高操作壓力的方式來緩解膜污染的速度。從發酵液中陶瓷膜法提取多拉菌素分為濃縮階段、洗濾階段和提取階段，相對前2批實驗，3個階段的通量降幅越來越小，越來越穩定，表明膜污染得以減緩。共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時245min，膜過濾通量可達119.5kg/(㎡·h)，比在膜面流速4m/s和操作壓力2.3bar時的通量提高了47.0%，收率可達97.5%。因此，采用階段性提高操作壓力有利于提高陶瓷膜過濾通量。

2.3 傳統工藝和陶瓷膜工藝的比較

根據“2.1”和“2.2”項的試驗結果，分別設計出多拉菌素發酵液處理能力為2t/h的傳統工藝和陶瓷膜工藝，并從設備運行成本、工藝設計和人工等進行比較。

以發酵液處理能力為2t/h（16t/d，300d/年）的傳統工藝和陶瓷膜工藝進行比較。傳統工藝需要配置5t/h處理量的國產離心機收集和洗滌菌體，處理時間8h；120m3的罐子進行甲醇攪拌提取，處理時間12h；還需20t/h處理量的進口離心機，用于提純多拉菌素，處理時間5h，再加上準備時間，總共耗時24h。而陶瓷膜工藝則需要配置4個91芯的組件，膜面積共152㎡即可實現生產需求，處理時間10h（包括清洗時間2h）。傳統工藝3個工段3班倒共需要12個人，而陶瓷膜工藝僅1班即可實現連續生產。且相對于傳統工藝，陶瓷膜工藝可減少一半甲醇提取用量，即每年可減少14400t的甲醇用量，收率還高出1.2%。傳統工藝的設備折舊費（折舊按10年計算，包括每年的耗材費）和人工成本使得整個運行成本超過陶瓷膜工藝（陶瓷膜折舊5年，膜設備折舊10年），每噸物料處理費用增加4.1元以上（不包括溶劑成本和收率折算后的利潤）。

2.4 陶瓷膜清洗方法

多拉菌素發酵液中含有較多的菌體、蛋白質以及培養基殘留成分等，陶瓷膜過濾會產生膜表面污染，甚至是膜孔內污染，影響陶瓷膜的下一次過濾性能。因此，必須對膜進行周期性的清洗。常規陶瓷膜的清洗可先用水沖刷，去除膜表明的可逆污染，由于陶瓷膜耐酸、耐堿、耐氧化劑的特性，再結合化學試劑和循環清洗對污染物進行分解、置換作用，通過錯流所形成的剪切力去除不可逆污染。

通過多次實驗考察，清洗方法如下：配置質量分數為1%～2%（以循環水質量計，下同）的NaOH和0.5%～1%的NaClO溶液進行循環清洗1h，再用清水沖洗至中性，陶瓷膜的水通量即可達到初始的99%，甚至更佳。

3 結論

3.1 傳統工藝和陶瓷膜工藝的優化

優化后的多拉菌素傳統工藝的收率達96.3%，甲醇提取次數2次，每次添加用量為3BV（質量比，相對于發酵液，以下皆同）。優化后的陶瓷膜工藝的收率達97.5%，膜面流速5m/s，溫度小于45℃，采用階段性提高操作壓力的方法，連續純水洗濾1.5BV，連續甲醇提取3BV，膜過濾通量可達119.5kg/(㎡·h)，比優化前提高了47.0%。

3.2 傳統工藝和陶瓷膜工藝的對比

比較了處理能力2t/h的傳統工藝與陶瓷膜工藝，陶瓷膜法操作時間縮減2倍，人工減少5倍，甲醇用量減少1倍，且收率仍然高出1.2%，每噸物料處理費用減少4.1元以上。

3.3 陶瓷膜的再生

采用質量分數為1%～2%的NaOH與0.5%～1%的NaClO混合清洗的方法，清洗后陶瓷膜的水通量重復恢復率可達99%以上，再生性較好。